2017年3月21日 星期二

單細胞研究的自我超越 – 10x Chromium 單細胞次世代定序系統更新


上週的專欄文章中,威健簡介了10x Genomics 的技術核心和應用特點。然而也就於上個月剛結束 (Feb. 13-17, 2017) 的基因組領域年度盛事第17屆 AGBT (Annual Advances in Genome Biology and Technology) 之中,10x Genomics 宣布推出新一版的單細胞應用方案,能更加簡化分析流程與視覺呈現 Chromium™ 單細胞 RNA 定序實驗的結果 (scRNA-seq),其中包括新增  Loupe™ 視覺化界面及更新版的 Cell Ranger™ 完整分析流程,讓使用者完美串接定序結果並能輕鬆進行後續資訊處理與資料探勘。

10x Genomics 軟體設備部門副總裁 Alexander Wong 表示:“單細胞 RNA 定量技術的進步,使得單一細胞內基因表現動態變化的綜合研究成為可能,但要進一步提昇分析細胞數量或者合併不同批次的研究題材,一直是軟體分析上的瓶頸。我們發表新的 Cell Ranger™ 完整分析流程,未來將可實現讓單細胞基因表現分析具有擴充性,並更容易由樣品端獲取富有意義的研究成果。”

Alexander Wong
Vice President, Software and Infrastructure

其中,Loupe™ Cell Browser 是一個易於使用、互動式的視覺化界面,可彙整分析結果來觀察細胞的基因表現狀況。在瀏覽界面下,研究人員能輕鬆辨識不同的細胞次分群,篩選或選定重要的基因,並輸出結果做進一步的分析和數據共享。




而 Cell Ranger™ 是一模組化分析流程,它能夠將細胞基因表現和各自細胞的 10x Barcode 分子標記彙整組合,一次性快速產生多達數千到數萬個細胞的基因表現狀況,並能夠輸出單個或多個樣品的 Loupe™ Cell Browser 檔案。 Cell Ranger™ 此次的更新大幅提升表現趨勢及聚合出細胞分群狀況,能在單細胞實驗中鑑定和解析更多的細胞次分群。新版本更針對計算性能進行最佳化,以便能夠分析超過一百萬個細胞的大規模實驗規劃。


如對於 10X Genomics 在單細胞領域的應用想了解更多,可直接到官網瀏覽相關資料庫。

https://support.10xgenomics.com/single-cell/software/downloads/latest

https://support.10xgenomics.com/single-cell/datasets/1M_neurons

2017年3月16日 星期四

臨床研究重要生物指標 - 尿液樣品的RNA研究小撇步

尿液的生物指標檢測向來是腎臟疾病及泌尿道系統異常評估的重要依據,來自以色列 Hadassah Medical Center 醫學中心的Ben-Dov及美國洛克菲勒大學的研究團隊共同研究探討除了傳統尿液檢查的蛋白質與代謝物之外,尿液中存在的核酸 (如RNA) 是否也能做為尿液生物指標檢測的另一種來源。

此項研究以健康的人為取樣來源,利用次世代定序技術 (Next Generation Sequencing , NGS) 評估尿液中不同成份來源 (細胞或胞外囊泡)、性別差異及不同尿段收集點的檢體,審視由尿液miRNA 的表現狀況來作為生物指標研究時可能存在的衝擊與影響。

實驗設計分別收集10位健康男性與10位健康女性自願者的尿液來進行RNA純化,然後比較男性與女性、細胞 (cell) 或胞外囊泡 (EVs, extracellular vesicles)、以及不同尿段收集點之miRNA表現量差異。



尿液胞外囊泡之miRNA萃取策略


尿液中RNA的主要來源為泌尿系脫落的細胞或細胞所分泌的胞外囊泡,為了分別這兩種來源,研究團隊先將50ml尿液離心來收集脫落的細胞,然後再吸取上清液得到cell-free的尿液,緊接著以濃縮管 (VS2042, Vivaproducts Inc., Littleton MA) 方式將尿液進行濃縮,最後利用Trizol LS進行胞外囊泡核酸萃取。

利用濃縮管粹取核酸之優點

  1. 同一管濃縮管分批濃縮能在固定成本之下, 取得來自更大體積樣品的核酸.
  2. 濃縮管比助沉澱劑來得經濟

純化獲得的RNA,以NGS定序出其表現量後以群組分析 (圖一) 及主成分分析(principal component analysis, PCA,圖二) 來針對不同種類small RNA的表現量進行分群,結果顯示不同來源 (Cell , EVs) 及不同性別 (男性,女性) 之尿液樣品確實會被歸類為不同群組。

圖一,以10位健康男性與10位健康女性自願者不同收集尿液時間之尿液,以二維群組分析small RNA的表現量及其歸群,不同來源 (Cell , EVs) 及不同性別 (男性,女性) 之尿液樣品確實會被歸類為不同群組,但不同收集尿液時間點並不影響歸群。

圖二,主成分分析miRNA表現之結果發現不同性別與來源 (Cell & EVs) 之尿液樣品確實有其差異性。

結論

以尿液或是其他體液的miRNA表現進行分析,雖然是相當方便且實用的生物指標評估,但是樣品的性別、與來源 (Cell or EVs) 差異影響確實不可忽略。


引用文獻

Cell and Microvesicle Urine microRNA Deep Sequencing Profiles from Healthy Individuals: Observations with Potential Impact on Biomarker Studies. Iddo Z. Ben-Dov, Veronica M. Whalen, Beatrice Goilav, Klaas E. A. Max, Thomas Tuschl PLOS ONE January 19, 2016

2017年2月23日 星期四

突破既有瓶頸 一次解決次世代定序的問題 - 10x Genomics Chromium 系統強勢登台

次世代定序技術的誕生,一改數十年來的研究步伐,以高通量、大數據、系統性、全面性的研究方式在全世界掀起熱潮,隨著技術改良與更新,二代定序已達前所未有的低成本定序能力,近年來,三代定序亦逐漸朝長片段定序發展,然而無論二或三代定序,皆有其不足之處尚待克服。

2015年在AGBT年會上,新創公司 10X Genomics 初次推出顛覆傳統次世代定序研究的 Gemcode 技術與分析平台,藉此大幅提昇 DNA組裝的完整性及應用性。2016 年則推出全新型態且效能顯著提升的 Chromium 分析平台,此平台將可深入至單細胞 (single cell) 等級的基因表現解析與觀測實驗中之數千顆「單細胞」基因表現及群體分布,再度為高通量大數據研究領域打開全新的一頁。




Chromium 分析平台
10x Genomics 在最新的 Chromium 平台中導入了兩大技術,第一是微流體油滴包覆技術 GEM (Gel bead in Emulsion),能將一個 bead 及所需大片段 DNA 樣品(或一顆細胞)連同實驗試劑包覆至單一油滴中。第二是獨創的 10x Barcode 系統,產生大約 100 萬種不同的功能性分子標記序列,分別嵌入至 bead 中,讓每個油滴僅帶有同一種 10x Barcode,下圖為 Chromium 兩大技術的實驗流程:


利用微流體通道引入精巧設計的多分隔油滴,包裹完整的單一細胞或完整的長片段DNA(>100k的完整片段),每個獨立油滴皆具有專一的10X barcode,足以鑑定每一個被包覆的單一細胞或完整長片段DNA是否屬於相同來源。
Chromium 的技術有別於以往,進行高通量短片段定序時,片段化的 DNA RNA 樣品庫 (library) 在定序分析後,會產生組裝不完整的問題。10x Genomics 利用其獨特技術,從根本解決:Chromium 能與現有的 illumine 平台相容,除保有短片段定序的正確性,亦能提高其片段組裝的完整度與正確性。表一統整四款高效率長片段序列解析平台,相比之下,10x Genomics的效能非常出色,此平台推出短短不到兩年,已被多國優秀團隊採用,例如:史丹佛大學團隊 [1] 與韓國研究團隊 [2] 皆曾透過此平台進行突破性的研究應用,其研究成果也已同步刊登於Nature等頂尖學術期刊。

台灣威健公司與10x Genomics原廠合作,成立全台第一且唯一的示範實驗室,致力推展此技術應用,克服現有研究瓶頸。我們針對既有應用成果完整解析、輔助建置完善技術平台,望能於此一新技術應用領域上,引領台灣,跟上世界腳步。
表一:統整完整長片段定序的主流平台 [3]




引用文獻
1. Grace, X Y Zheng Nat Biotechnol. 1 February 2016. doi:10.1038/nbt.3432
2. Seo, J.S. Nature. 13 October 2016. doi:10.1038/nature20098
3. Hayan Lee biorxiv pre-print. doi.org/10.1101/048603

2016年11月11日 星期五

基因編輯的新世代來臨 - CRISPR 技術起源與簡介


我們都知道人類及各種動物在有病毒及病菌感染的情況下,會啟動自身白血球的免疫系統來抵禦外來物,由抗原呈現細胞 APC (antigen-presenting cells) 、 T細胞和B 細胞的合作分工之下,能辨識並對相同的外來物啟動更快速有效的防禦機制 (Fig 1),這種記憶分工的免疫效應過去曾以為只存在於真核多細胞生物。不過在原核生物中,其實也擁有它們自己的記憶性免疫系統,其中一種就是近幾年發展火熱的分子生物技術 CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 的起源。

2016年6月16日 星期四

[生技新知] 最真實的表觀調控分析!? 全新的單細胞 Methylome 及 Transcriptome 同時分析技術



  不久前由英國與比利時的研究團隊發展出全新的單細胞表觀遺傳研究技術,可於同時間進行單細胞的 epigenome 和 transcriptome 分析,藉此來連結DNA甲基化和基因表現的關聯性,此技術帶來的效益或許能更加瞭解在一般狀況、老化或者疾病癌症時生物體中的多樣性調控機制。

2015年12月23日 星期三

[生技小知識] 模式物種之猿力崛起




Chimpanzee (chimps, 黑猩猩),分類為靈長目 (Primates) 黑猩猩屬 (Pan),學名為 Pan troglodytes,是現今研究常用的 model organism 之一,其基因和人類的相似度極高,僅有1% ~ 2% 的基因差異。


[生技小知識] 移除238個老化基因,人人都可「呷百二」?



美國Buck Institute與華盛頓大學數名科學家合作長達十年的研究,藉由4698株酵母菌(S. cerevisiae yeast cells)複製生長的能力做為年齡評估標準,利用基因工程的方式逐一剔除每個基因,最終發現了238個基因與老化相關!剔除這些老化基因不僅可延長酵母菌的生長能力,最多還能增加60%的生存時間,因此若以人類平均壽命75歲計算,大概可延長到120歲。