臨床研究重要生物指標 - 尿液樣品的RNA研究小撇步

尿液的生物指標檢測向來是腎臟疾病及泌尿道系統異常評估的重要依據,來自以色列 Hadassah Medical Center 醫學中心的Ben-Dov及美國洛克菲勒大學的研究團隊共同研究探討除了傳統尿液檢查的蛋白質與代謝物之外,尿液中存在的核酸 (如RNA) 是否也能做為尿液生物指標檢測的另一種來源。

此項研究以健康的人為取樣來源,利用次世代定序技術 (Next Generation Sequencing , NGS) 評估尿液中不同成份來源 (細胞或胞外囊泡)、性別差異及不同尿段收集點的檢體,審視由尿液miRNA 的表現狀況來作為生物指標研究時可能存在的衝擊與影響。

實驗設計分別收集10位健康男性與10位健康女性自願者的尿液來進行RNA純化,然後比較男性與女性、細胞 (cell) 或胞外囊泡 (EVs, extracellular vesicles)、以及不同尿段收集點之miRNA表現量差異。



尿液胞外囊泡之miRNA萃取策略


尿液中RNA的主要來源為泌尿系脫落的細胞或細胞所分泌的胞外囊泡,為了分別這兩種來源,研究團隊先將50ml尿液離心來收集脫落的細胞,然後再吸取上清液得到cell-free的尿液,緊接著以濃縮管 (VS2042, Vivaproducts Inc., Littleton MA) 方式將尿液進行濃縮,最後利用Trizol LS進行胞外囊泡核酸萃取。

利用濃縮管粹取核酸之優點

  1. 同一管濃縮管分批濃縮能在固定成本之下, 取得來自更大體積樣品的核酸.
  2. 濃縮管比助沉澱劑來得經濟

純化獲得的RNA,以NGS定序出其表現量後以群組分析 (圖一) 及主成分分析(principal component analysis, PCA,圖二) 來針對不同種類small RNA的表現量進行分群,結果顯示不同來源 (Cell , EVs) 及不同性別 (男性,女性) 之尿液樣品確實會被歸類為不同群組。

圖一,以10位健康男性與10位健康女性自願者不同收集尿液時間之尿液,以二維群組分析small RNA的表現量及其歸群,不同來源 (Cell , EVs) 及不同性別 (男性,女性) 之尿液樣品確實會被歸類為不同群組,但不同收集尿液時間點並不影響歸群。

圖二,主成分分析miRNA表現之結果發現不同性別與來源 (Cell & EVs) 之尿液樣品確實有其差異性。

結論

以尿液或是其他體液的miRNA表現進行分析,雖然是相當方便且實用的生物指標評估,但是樣品的性別、與來源 (Cell or EVs) 差異影響確實不可忽略。



引用文獻

Cell and Microvesicle Urine microRNA Deep Sequencing Profiles from Healthy Individuals: Observations with Potential Impact on Biomarker Studies. Iddo Z. Ben-Dov, Veronica M. Whalen, Beatrice Goilav, Klaas E. A. Max, Thomas Tuschl PLOS ONE January 19, 2016

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